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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化突显组学、LC-MS/MS磷碱化位点定性分析技术服务。
因为文章标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
英文版大标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
业主工作单位：山东大学
实验涂料：拟南芥侧根
拜谱提高的技术：磷酸性反应突显组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点介绍
实验难点：
PART 01 研发导致
01、繁殖素有助于VIK的磷过酸极其转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用血清质酚类化合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 出现素带动VIK的磷硝化作用举例转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷过酸实践。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过鲜酵母双混种浅析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相辅相成激光散斑研究（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时监控酶联免疫法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素警报更好地调整 LR 健康成长
用讲解两大VIK T-DNA放甲基化体（vik-2和vik-3），知道与野山型相比之下，甲基化体的LR相对孔隙率、LR原基（LRP）和已健康的LR正相关下降，愈加是vik-2（图2）。相反的词语，过展现VIK的转染色体主茎成绩出LR相对孔隙率提升。再者，在vik-2甲基化体的背景下展现VIK的转染色体主茎回到了LR健康的缺陷。产生素清理检测表述，vik-2甲基化体对产生素成脂的LR健康反馈减小，表述VIK在产生素调节管控LR健康中引领重要的功能。 
图2 VIK介导的生長素无线信号信号通路单向改善LR的发育期
03、VIK 与ERF13 实行力学等交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光相容 （BiFC）和抗体共滤渣实验室（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13相护意义
04、VIK以正反面馈的方试自我调节ERF13磷过酸
通过磷过酸淀粉酶组学研究分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变率表明显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈手段磷硝化作用ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷碱化带动ERF13光降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体之外實驗性和肚子里實驗性，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸降解甲基化体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚細胞追踪定位解析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应变快了ERF13降解塑料
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化调结 LR 的冒出
的研究进两步研讨了VIK国家宏观调控的ERF13吸附在侧根（LR）發育中的的用途。用相当有所差异转表观遗传绿植的系的LR表型，发现 了过展现出来出来ERF13减缓了LR的经常发现，在vik基因遗传变异体中以下减缓的用途强化，而在过展现出来出来YFP-VIK的底色下以下减缓的用途变弱（图6）。显然，相当ERF13的有所差异磷硝化作用模仿仿真和磷酸分解遗传变异体的过展现出来出来绿植的系，发现 了ERF132A-Myc（磷酸分解）的绿植的系LR经常发现少点，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模仿仿真）的绿植的系LR经常发现略多。以下结果显示是因为，VIK介导的ERF13磷硝化作用和吸附有助于了LR的经常发现。 
图6 VIK介导的ERF13磷酸性反应使得LR的出现了
07、VIK在侧根成长发育中磷过酸并保持稳定LBD18球蛋白
完成解析3个VIK T-DNA复制甲基化体（vik-2和vik-3），遇到与也是型不同之处，甲基化体的侧根（LR）高密度计算公式、LR原基（LRP）和已阴茎成长发育成熟状况的LR不错增多，还是比较是vik-2（图7）。相左，过表答VIK的转人类基因遗传茎叶主要表现出LR高密度计算公式增高。不但，在vik-2甲基化体大环境下表答VIK的转人类基因遗传茎叶恢愎了LR阴茎成长发育成熟状况偏差。产生素治理 实验报告揭示，vik-2甲基化体对产生素促进的LR阴茎成长发育成熟状况反应迟钝减低，揭示VIK在产生素自我调节LR阴茎成长发育成熟状况中充分利用重要性帮助。 
图7 VIK 在LR产生方式中可以直接磷酸性反应和比较稳定LBD18蛋白酶
PART 02 内容个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化球蛋白质含量组学分享筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的植物的生长素信息可以调节侧根养成
PART 03 拜谱总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋清质组学、绘制蛋清质组学、新陈代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—混凝土泵送角度DIA·磷碱化淡化组，采用创新丰度系统+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现家禽样版10w+、常绿植物样版5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参考使用期刊论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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